甲萘醌-7（MK-7）是VK2的一种亚型，是一种由2-甲基-1,4-萘醌环和7 个异戊二烯单元组成的脂溶性维生素。它在预防和治疗许多常见疾病方面具备极其重大的生理功能，如心血管疾病、阿尔茨海默病、糖尿病和骨质疏松症等。目前，MK-7的微生物合成大多分布在在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（
SinR基因构建了工程菌株BS168-ΔSinRSinR基因是枯草芽孢杆菌生物膜形成的关键抑制基因，该基因缺失使得工程菌株在静置发酵下生成了大量聚集在培养基表面的生物膜。有研究表明，生物膜的形成能够在一定程度上促进MK-7的生物合成。细胞膜的有限容量本质上决定了MK-7的最大产量。同时，当细胞内MK-7的不间断地积累会对细胞造成毒性，从而引起合成途径的负反馈抑制，进而限制了MK-7的合成。因此，如果能促进MK-7的胞外分泌，就能刺激胞内MK-7的持续产生，MK-7的总产量将大幅度的提升。近年来，表面活性剂已被大范围的应用于提高各种代谢产物的产量。表面活性剂分子具有类似于磷脂分子的两亲性，由于分子之间的相互作用力而分布到膜中，当足够数量的表面活性剂分子在细胞膜中聚集形成胶束时，它们会溶解磷脂分子，从而增加细胞膜的渗透性。因此，认为细胞膜的渗透性可能是影响MK-7分泌的重要的条件之一，从渗透性的方面出发尝试通过表面活性剂介导细胞膜渗透化的方法，探究其对MK-7产量的影响。
安徽工程大学生物与食品工程学院的陶伟、刘艳*，安徽安科余良卿药业有限公司的刘海兵等以BS168-Δ
SinR为起始菌株，筛选了可能提高工程菌株MK-7产量的表面活性剂，并对其进行浓度梯度优化。通过扫描电镜的观察和流式细胞仪、荧光显微镜的检测，进一步了解膜透化对细胞形态和细胞膜渗透性所产生的影响，并利用RNA-seq深入分析膜透化对提高MK-7产量相关基因的影响，以期为MK-7的工业化生产和表面活性剂介导的生物制造提供理论依照，也为功能性食品的开发奠定坚实的基础。
测定不同表面活性剂对菌株的生物膜量和MK-7产量的影响。阳离子表面活性剂CTAB和阴离子表面活性剂SDS对菌株具有着强烈的毒性。添加0.5% CTAB或SDS时，细胞失去活性，生物膜形成被完全抑制（图1A），发酵液中生物膜和MK-7均未检测到（图1B、C）。这可能是由于高浓度CTAB和SDS严重破坏了细胞膜完整性，引起细胞内容物（如离子、蛋白质和核酸）泄漏，并干扰细胞膜上蛋白质和酶的正常功能，最后导致细胞结构和代谢功能的崩溃。两性离子表面活性剂Betaine在溶液中呈阳离子和阴离子两种状态，其具有非极性固体表面单层的吸附能力，从而增强了菌株对营养的东西的吸附。添加0.5% Betaine促进了生物膜的形成和生物膜量的增长，但MK-7产量并未提高。
Tween-80和Brij-58是非离子表面活性剂，添加0.5% Tween-80的生物膜呈灰色颗粒状聚集体，添加0.5% Brij-58的生物膜呈深红色蚯蚓状隆起，并伴有大量褶皱（图1A）。有研究表明，褶皱的形成促进了膜内通道网络的连接，降低了液体流动的阻力，使通道内压力小于外部大气压，这种压力梯度能够在一定程度上促进营养的东西流过生物膜，最终影响次级代谢产物的合成。在该实验中，Brij-58明显提高了生物膜量和MK-7产量。添加0.5% Brij-58的菌株，其生物膜量达到（131.07±2.27）g/L，较对照组提高44.78%；MK-7总产量达到（82.85±1.08）mg/L，较对照组提高45.97%，其中胞外MK-7产量达到（60.09±1.6）mg/L，较对照组提高291.98%。这些根据结果得出，合适的表面活性剂可有效提升菌株的MK-7产量。同时，发现Brij-58导致的细胞膜渗透化显著促进了MK-7的胞外分泌。
鉴于Brij-58对菌株胞外分泌MK-7有显著的影响，对其添加量优化。在添加0.7% Brij-58的条件下，菌株的MK-7总产量达到（97.59±1.30）mg/L，较对照组提高71.95%，其中胞外MK-7产量达到（66.27±0.78）mg/L，较对照组提高332.29%（图1D）。该添加量下，菌株生长在前期受到了一定的抑制，但在72 h后逐渐恢复（图1E），144 h生物量略高于对照组。当Brij-58添加量提高至0.9%和1.1%时，菌株生长受到明显抑制，144 h生物量较对照组分别下降了16.5%和19.5%，进而导致MK-7总产量下降。上述根据结果得出，0.7%为Brij-58最优添加量，可在维持菌株生长的同时最大化MK-7的产量。
为深入了解Brij-58介导的膜透化所产生的影响，观察生物膜形成的过程，并检测生物膜量和MK-7产量的变化。对照组菌株在48 h已形成大量生物膜（图2A），其生物膜量随时间逐渐积累，于96 h达到最大值（图2B），然而在144 h生物膜出现自溶现象，生物膜量降低至（90.53±0.90）g/L。Brij-58组（添加0.3% Brij-58和0.7% Brij-58）菌株，其生物膜形成受到明显抑制，分别在96 h和120 h才完全形成。这可能是由于Brij-58会导致细胞膜结构伤害损坏，进而抑制菌株前期的生长繁殖（生物量积累缓慢），最终延缓了生物膜的形成。在高浓度Brij-58条件下，48 h前，由于菌株生长受抑制，生物膜量增长缓慢；48 h后，生物膜量则明显地增加，最终在144 h时，0.3% Brij-58和0.7% Brij-58组的生物膜量分别达到（121.73±1.60）g/L和（130.85±1.14）g/L。
测定菌株在48、96 h和144 h 3 个时间点的MK-7产量（图2C）。在高浓度Brij-58条件下，发酵前期菌株MK-7的分泌受到限制，但发酵后期转而促进MK-7的分泌，尤其是胞外MK-7的分泌，使得Brij-58组的胞外MK-7产量明显高于对照组。有必要注意一下的是，96 h的MK-7产量与生物膜量的变化趋势并不一致，这表明生物膜仅是影响MK-7产量的诸多因素之一。虽然高浓度Brij-58会抑制菌株前期的生长繁殖，进而限制EPS和MK-7的分泌，但随着菌株生物量逐渐积累，Brij-58导致的细胞膜渗透化作用开始显现，不仅促进了营养的东西向胞内的运输，也明显地增强了EPS和MK-7等代谢产物向胞外的分泌。
通过扫描电镜观察膜透化对菌株细胞形态的影响。如图3所示，未添加Brij-58的菌株，细胞呈典型的长杆状（形态饱满），表面十分光滑、完整、无缺损痕迹（图3A1）。添加0.3% Brij-58的菌株，细胞表面出现皱纹、凹陷，极少数细胞出现裂纹（图3A2），表明该添加量条件下膜透化开始影响细胞膜的流动性，但尚未损伤细胞形态结构。添加0.7% Brij-58的菌株，细胞形态显著改变，表面粗糙化并附着大量活性胶束（图3A3）。此现象源于Brij-58和磷脂双分子层相互溶解形成的混合胶束，其能改变细胞膜结构，有利于营养的东西进入胞内以及代谢产物分泌到胞外。
同时，将0.7% Brij-58处理6 d的菌株转移至无Brij-58体系进行3 代恢复实验。在无Brij-58的LB培养基中连续传代3 代，其生长曲线与对照组（未用Brij-58处理的菌株）的生长趋势基本一致（图3B）；在无Brij-58的发酵培养基中，连续发酵3 代的MK-7总产量稳定维持在56～60 mg/L（图3C）；扫描电镜显示，细胞表面活性胶束完全消失，恢复光滑、完整的特征（图3D）。这些根据结果得出Brij-58介导的膜透化具有可逆性，且不影响菌株的长期代谢活性和遗传稳定性。
PI是一种带正电荷的核酸结合探针，大范围的应用于细胞膜渗透性评估，其能够扩散到死细胞中与核酸结合以产生红色荧光。然而，进一步研究之后发现，并非所有被PI染色的细胞都是死细胞，细胞膜受损的细胞也能够被染色并检测到。因此，通过检验测试PI结合细胞的荧光强度评估膜透化对细胞膜渗透性的影响。
如图4所示，将未染色的细胞设为阴性对照（图4A1），将100 ℃灭活并染色的细胞设为阳性对照（图4A2）。将PI阳性细胞区域设为门，门内细胞比例越高，表明死亡或膜受损的细胞比例越大。由于自发性细胞凋亡，对照组（未添加Brij-58）细胞的PI阳性比例达到11.94%（图4A3），在Brij-58组（添加0.3% Brij-58和0.7% Brij-58）中，细胞的PI阳性比例随添加量增加而升高，从19.03%增至28.40%（图4A4、A5）。荧光显微镜观察结果（图4B）显示，各组荧光强度的差异表明Brij-58对细胞膜的损伤呈浓度依赖性，这与流式细胞仪结果一致。这些结果证实了膜透化明显地增加了细胞膜渗透性。而膜渗透性的增加有助于营养物质的吸收和代谢产物的分泌，这与Yi Yunxin等的研究结果一致，也与其他研究中通过表面活性剂增加膜渗透性以促进代谢产物分泌的作用机制相符。
为探究Brij-58介导的膜透化对提高MK-7产量相关基因的影响，对样品进行RNA-seq转录组测序。以错误发现率≤0.05、log2差异倍数（fold change，FC）≥1为条件筛选样品间的DEGs。根据火山图显示（图5A），共筛选出1 582 个显著DEGs，其中显著上调和下调基因分别为846 个和736 个。将筛选得到的DEGs注释到GO数据库中并映射到不同的途径。GO功能富集分析（图5B）显示，大部分DEGs显著富集于细胞过程、代谢过程和催化活性。KEGG通路富集分析（图5C）显示，共有16 条通路显著富集，最重要的包含ABC转运蛋白、磷酸转移酶系统、碳代谢、氧化磷酸化和群体感应等。其中，ABC转运蛋白和磷酸转移酶系统两条通路与膜转运相关，这可能与MK-7分泌有联系。
如图6所示，枯草芽孢杆菌的MK-7生物合成通路可分为4 个模块，即甘油代谢途径、莽草酸（SA）途径、2-
C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径、MK-7途径。在甘油代谢途径中，胞外的甘油需经甘油通道蛋白（由GlpF基因编码）摄取进入胞内。进入胞内的甘油依次经甘油激酶（由GlpK基因编码）和甘油-3-磷酸脱氢酶（由GlpD基因编码）催化，生成磷酸二羟丙酮（DHAP），随后进入糖酵解途径。在添加Brij-58的条件下，GlpFGlpKGlpD分别上调了0.46、0.11 倍和0.08 倍。已有研究发现，GlpKGlpD的过表达可加快菌株对甘油的消耗，导致MK-7产量提高10%。这些根据结果得出，Brij-58介导的膜透化增加了菌株对底物甘油的摄取和消耗，促进了DHAP的合成。这有利于更多的甘油醛-3-磷酸（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）流向SA途径和MEP途径，从而为MK-7合成提供前体物质。
SA途径为MK-7的主链提供了重要前体物质分支酸（chorismate，CHA），CHA也是芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）以及多种芳香族化合物的重要前体物质。在SA途径中，
AroAAroBAroCAroD分别上调了1.28、0.32、0.45 倍和0.21 倍。这些基因的上调极大地促进了赤藓糖-4-磷酸（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）向CHA的转化，因此导致CHA的迅速积累，使得流向MK-7途径的碳通量增多。而AroKAroE均下调，这可能与CHA积累导致的芳香族氨基酸浓度升高有关。已有研究表明，高浓度的芳香族氨基酸会通过反馈抑制机制调控SA途径相关基因的表达。
MEP途径是合成异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的关键途径，这两种化合物在庚烯基焦磷酸合酶（由
HepSHepT基因编码）催化下，缩合形成MK-7侧链的重要前体物质七异戊二烯基焦磷酸（HepPP）。在MEP途径中，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（由Dxs基因编码）和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（由Dxr基因编码）被认为是这一途径的限速酶，其分别上调了0.50 倍和1.35 倍。该结果与先前的研究一致，DxsDxr共同过表达可使MK-7产量提高4.6 倍。此外，该途径中其余酶的基因表达均不同程度的上调。这些变化均有利于IPP和DMAPP的积累，从而为MK-7异戊二烯侧链的合成提供更多的前体物质。
MK-7途径是MK-7生物合成通路的最终步骤，该途径将SA途径提供的CHA和MEP途径提供的HepPP，通过多种酶的协同作用转化为MK-7。在MK-7途径中，9 种酶的基因表达均发生不同程度的变化，其中
MenDMenAMenG分别上调了1.54、0.60 倍和1.26 倍。有研究表明，在枯草芽孢杆菌中过表达MenD可使MK-7产量提高80%，这证明了MenD是MK-7途径中的限速酶。Huang Wei等发现，在枯草芽孢杆菌中过表达MenA可使 VK 2 产量 提高89%，这进一步支持了MenA在MK-7途径中的重要性。此外，在脑膜败血伊丽莎白菌中MenG/UbiE的过表达也可使MK产量提高1.41 倍。
枯草芽孢杆菌的营养细胞会在营养缺乏、温度过高或过低、pH值不适宜等恶劣环境下分化为孢子。有研究表明，孢子的形成会减缓或停止MK-7的生物合成。如图7所示，在孢子形成的磷酸化系统中，
Spo0A是孢子形成的主要转录调控因子，可通过磷酸化促进孢子的形成，其与其余孢子形成相关的基因表达水平均下调，这可能是由于Brij-58导致菌株前期的生长繁殖受到抑制，使得发酵周期延长，进而延缓了孢子形成的时间。该结果与图2趋势一致。
在枯草芽孢杆菌的生长繁殖过程中，活性氧（ROS）的产生不可避免。ROS水平越高，对细胞造成的损伤越大，这可能间接影响MK-7的积累。有研究发现，表面活性剂CTAB的添加会导致ROS的积累，从而损伤细胞膜结构、增加细胞膜渗透性，最终使甘露肽产量提高了98.6%。此外，已有研究证实，ROS的积累会导致抗氧化防御系统相关基因的上调。为进一步探究ROS对MK-7产量的影响，对抗氧化防御系统相关基因的表达水平做多元化的分析。如图7所示，编码超氧化物歧化酶（主要负责清除细胞内的超氧化物自由基）的基因
SodCSodF分别上调了0.58 倍和2.24 倍。编码烷基过氧化氢还原酶系统（主要负责清除细胞内的过氧化氢）的基因AhpAAhpCAhpF分别上调了0.49、0.15 倍和0.18 倍。这些基因的上调表明，Brij-58的添加导致了ROS的大量积累，从而诱导膜结构伤害损坏及膜渗透性增加。该结果与图3和图4趋势一致。
SinR作为起始菌株，重点探究了表面活性剂介导的膜透化对工程菌株MK-7产量的影响。研究根据结果得出，添加表面活性剂可有效提升菌株的MK-7产量。通过对多种表面活性剂进行筛选和添加量梯度优化，发现添加0.7% Brij-58可明显提高MK-7产量，使得MK-7总产量较对照菌株提高了71.95%，其中胞外MK-7产量提高了332.29%。通过观察生物膜形成并检测生物膜量和MK-7产量变化，发现Brij-58介导的膜透化在前期会抑制菌株的生长繁殖，从而限制代谢产物的分泌，但在后期有效促进了MK-7的胞外分泌，并缓解了胞内MK-7积累引起的反馈抑制。此外，扫描电镜、流式细胞仪和荧光显微镜的结果进一步证实了膜透化与MK-7产量提高之间的内在联系。同时，通过实验证明了Brij-58介导的膜透化具有可逆性，且不影响菌株的长期代谢活性和遗传稳定性。最后利用RNA-seq深入分析膜透化对提高MK-7产量相关基因的影响（直接或间接），结果显示，大多数与MK-7生物合成和抗氧化防御系统相关的基因表达水平显著上调，而孢子形成相关的基因表达水平均下调。
综上，本研究的结果为表面活性剂介导的膜透化提高MK-7产量的作用机制提供了理论依照，对推动MK-7可持续工业化生产具备极其重大意义。后续研究可逐步优化代谢途径中关键调控基因的表达，并探索更高效的发酵策略，以实现MK-7产量的进一步提高。
教授、博士生导师、安徽省领军人才特聘教授，安徽工程大学合成生物学与微生物制造团队带头人。中科院合肥物质科学院生物物理学博士，美国弗吉尼亚联邦大学访问学者，安徽省生物工程学会常务理事。先后主持国家自然科学基金（面上、青年）3 项，安徽省自然科学基金、省高校杰出青年基金等省部级项目10余项。发表高水平SCI论文30余篇，授权国家发明专利12 件（其中国际专利2 件）。主要是做发酵过程中群体微生物结构与功能、微生物及其代谢机理、微生物新酶及其分子改造等研究工作，从基因组学、蛋白组学和代谢组学的水平上，解析微生物发酵机制、探索微生物酶蛋白的结构与催化功能的相互关系，提升和改造传统发酵工艺，采用合成生物学技术发掘和延展新的生物制作的完整过程，满足工业生物制造的需求。
本文《表面活性剂介导的膜透化对枯草芽孢杆菌工程菌产甲萘醌-7的影响》来源于《食品科学》2025年46卷第19期98-106页，作者：陶伟，刘海兵，郭明雨，刘永圆，Elvis Kwame ADINKRA，李瑜琪，马月欣，陈 宇，吴传超，刘艳*。DOI:10.7506/spkx0402-012。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：农梦琪；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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